Paxlovid的印版绿盒Primovir一剂要命的毒药
本帖最后由 西瓜籽 于 2023-1-18 09:08 编辑作者：Keenman
新冠病毒疫情发生三年来，受国情和政府执政能力所限，国外经历了新冠病毒原始毒株、阿尔法变异株、德尔塔变异株以及奥密克戎变异株等多种毒株的洗礼。在防止新冠病毒传染以及治疗新冠病毒感染方面积累了丰富的经验，这些用生命探索和积累的抗疫经验是十分宝贵的财富，值得我们在迎接奥密克戎变异株挑战时参考借鉴。
在新冠病毒感染早期，病毒在快速复制阶段时使用抗病毒药物具有无可比拟的优势，而在所有抗病毒药物中，小分子药物的优势更加明显：（1）大部分的小分子药物给药方便，方便轻症患者治疗（感染后，暴露前，暴露后等治疗）；（2）可作用于细胞内（包括细胞核内靶点）与细胞外的靶点；（3）小分子药物对储存环境的敏感性相对较低，储存运输方便；（4）几乎没有免疫原性；（5）具有相对保守的靶点。
Paxlovid“新冠封神”的底气在哪儿？
辉瑞公司开发的Paxlovid（音译帕罗维德）就是其中的佼佼者。2021年11月5日，辉瑞发布了一项研究，宣称在第二和第三期EPIC-HR(指对高危患者的新冠肺炎的蛋白酶抑制进行评估)临床试验的中期分析中，新型抗新冠口服药Paxlovid将住院或死亡风险降低了 89%。考虑到一方面是欧美人种，另一方面2021年时流行的主要是致病率更高的德尔塔毒株，那针对中国人种以及目前正在流行的奥密克戎变异株，Paxlovid的表现如何呢？2022年初我国香港的真实世界研究可以提供重要的参考。
2022年10月8日，《柳叶刀》发布了一项中国香港关于两款新冠口服药Molnupiravir（注：默沙东公司的莫诺拉韦胶囊，也于2022年12月30日在中国获批上市）和Paxlovid对治疗奥密克戎感染有效性的真实世界研究。
在研究中，研究者分析了2022年2月26日至6月26日期间，11847名服用过Molnupiravir或Paxlovid患者的记录，他们大多都属于新冠感染的高危人群——年龄超过60岁，且未完成疫苗接种。
研究发现，Molnupiravir治疗组的全因死亡率为17.9/100000人日，相比对照组降低了24%；Paxlovid治疗组则为4.2/100000人日，相比对照组降低66%。
近日，NIH（美国国家卫生研究院）评论了目前最大型一个Paxlovid真实世界研究结果，这项来自于哈佛医学院和BWH的研究于2022年12月13日发表在Annals of Internal Medicine上。
这项研究在2022年1 月 1 日至 7 月 17 日Omicron BA.1，BA.2和BA.5期间入组了44,501名年龄50岁以上中老年新冠感染患者，绝大多数接种过疫苗。和Paxlovid的3期临床试验不同之处在于，在这个时间段美国COVID-19住院比例小于1%。
12,541名年龄更大或有基础病患者接受了Paxlovid治疗，32,010没有接受Paxlovid。研究发现，相对没有服用Paxlovid患者，Paxlovid组患者组住院降低40%，死亡降低71%。
之前美国CDC发表的真实世界研究显示，对于接种了加强针的成年患者来说，服用Paxlovid在真实世界中降低了51%的住院风险；并在大部分成年组别中展示了这个强有力的高效性。但对于18-49岁且接种了3剂或以上疫苗的人群、18-49岁只有一种高危基础疾病的人群、以及50-64岁无基础疾病的人群中，Paxlovid治疗与是否住院风险的差异无统计学意义。
Paxlovid的抗病毒机理及副作用的来源
辉瑞的Paxlovid是由奈玛特韦（Nirmatrelvir）和利托那韦（Ritonavir）组成的双组分口服复合制剂，一板药中会有两片奈玛特韦（150mg/片）、一片利托那韦（100mg/片），每次需要同时服用这三片，每12小时服用一次。
为何要采用这种服用方法呢？因为在Paxlovid中起抗病毒作用的是奈玛特韦，它是一种口服的MPro（main protein，主蛋白酶，又称3CLPro）抑制剂。
新冠病毒入侵细胞后，会立即利用细胞内的物质合成自身复制传播所必需的两条超长复制酶多肽（pp1a和pp1ab）；MPro在复制酶多肽上存在至少11个切割位点，只有当这些位点被正常切割后，这些病毒复制相关的「零件」才能顺利组装成复制转录机器，启动病毒的复制。如果阻断了主蛋白酶、不能完成切割，那病毒就不可能进行组装。
这一过程就像乐高积木，如果没有形状各异的积木块，就很难搭建起合格的积木成品。而这个MPro酶就相当于是制作不同形状积木块的机器，它被抑制住了之后，就无法制造出形状各异的积木块，进而无法搭建出复杂的积木成品。
但奈玛特韦的口服生物利用度低，口服之后，很容易被肝药酶代谢，失去抗病毒的作用。而Paxlovid中的另一组分利托那韦则是CYP3A酶的抑制剂，用利托那韦来抑制住CYP3A酶的活性，尽可能慢的代谢奈玛特韦，来维持住奈玛特韦的血药浓度，发挥它抗病毒的作用。
由于CYP3A酶在肝脏里负责很多药物的代谢，比如老年人常见的降压、降脂、降血糖的药物很多都是通过CYP3A酶来代谢，服用利托那韦之后，肝脏内的CYP3A酶的活性被抑制，服下去的降压药、降脂药、降糖药等一些药物在体内就不能及时代谢，会增加药物毒性。
另外也有一些药物是“前药”，需要在体内通过CYP3A酶代谢之后，生成的底物才有药物活性，CYP3A酶的活性被抑制之后，这些“前药”没法代谢变成有药物活性的底物，就起不到药效，所以利托那韦和很多药物会有比较明显的相互作用。这也导致服用Paxlovid时需要遵医嘱，严格对照药物说明书中识别可能的药物相互作用，必要时调整用药。
“世界药房”的印版Paxlovid靠谱吗
国内疫情防控政策突然转向，Paxlovid备货不足，而重症患者又急缺有效的抗病毒药物，导致Paxlovid一药难求，黑市上甚至被炒到了1.2万/盒。很多人就想到了“我不是药神”电影中的世界药房——印度。
朋友圈里充斥着各种代购辉瑞授权的印版Paxlovid，其中流传较多的就是HealthCare pvt ltd生产的Astrica品牌的Primovir（由于外包装为绿白相间，所以也经常被称为绿盒）。就是这绿盒的仿版Primovir，前段时间被微博大V凯喜博士爆出90%为假货，其中的奈玛特韦片中不含有奈玛特韦有效物成分，取而代之的是奥司他韦，或者就是另外一个形状的利托那韦。
这个性质就严重了，在前面已经介绍过了，Paxlovid的两组分中，起抗病毒作用就是奈玛特韦，而利托那韦是为了维持住奈玛特韦的血药浓度去抑制CYP3A酶，和降脂、降糖、降压等老人常用的药物起相互作用也主要是利托那韦引起的。
现在里边没有抗病毒的有效成分，全是利托那韦这种引起药物相互作用的成分，这比吃一个淀粉药片对人体的危害还大。尤其是应用于60岁以上，没打过疫苗的高风险人群，不但无效还会带来很多副作用，原本是用来“救命的神药”，却变成了“害人的毒药”，这种造假简直天理难容。
而恰恰一个朋友就通过澳门高价代购了8盒绿盒的Primovir，原本是想给亲朋好友备着，以备不时之需，但看到凯喜博士的微博之后，陷入了深深的焦虑。到底这8盒Primovir是真还是假。如果是假的，损失了2万多块钱不说，关键是如果给亲朋好友用了无效反而耽误了治疗，这事儿就大了。但没去检测，就这么决定把这8盒Primovir扔了，又有点不甘心，万一是那10%有效的呢？
送凯喜博士那边检测，检测费倒也不是很贵500元/个样品，但如果只检测一盒的话，只代表这一盒，也不能证明剩下的7盒的真假。最好的办法是，从这8盒里每一盒都取一个样品去检测，如果万一是真的，虽然少了一粒奈玛特韦，但并不影响后续的使用。而这样送凯喜博士那边的检测费就500*8=4000元了，又觉得为一个极大可能是假药的结果，再投入4000元，有点不划算。
亲测印版绿盒Paxlovid，揭露绿盒的害人本质
以往论坛的去伪存真栏目曾经专门针对印版和孟加拉版的奥希替尼做过检测，对于判断一个药物中是否含有有效组分，有丰富的经验。采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）外标法，对照着标准品检测一下测试样的出峰时间和峰面积就能得出测试样中是否含有有效成分，以及相对含量多少。（点击阅读《去伪存真，神药AZD9291孟加拉仿制版：孟加拉“双雄”到底行不行》）
本次检测采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行检测，检测所需具备的两个条件已经具备：
第一是要有HPLC的色谱条件，这是液相色谱检测重要的参数；
第二是要有奈玛特韦的标准品；
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）简单科普
高效液相色谱（HPLC）具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点。
它的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationphase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。也就是说待测物质在色谱柱中，其各成分会被分离后，按照时间先后从色谱柱中流出，再进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
液相色谱的检测器常见的有紫外-可见光检测器、荧光检测器、质谱，一般单独的HPLC采用紫外-可见光检测器比较多。而本次我们用的则是液相色谱-质谱联用（LC-MS）。
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）是以质谱仪为检测手段，集HPLC高分离能力与MS高灵敏度和高选择性于一体的强有力分离分析方法。它的基本流程为：混合的样品经高效液相色谱柱分离后成为多个单一组分，依次通过液相色谱／质谱接口进入质谱仪的离子源，离子化后的样品经过质量分析器分析后由检测系统记录，后经数据系统采集处理，得到带有结构信息的质谱图。
分析的关键是将所获得的被分析物的谱图与谱库里的谱图进行比较，在谱库中是否存在具有和该物质特征一致的样品的谱图。或者是和标准品的谱图进行对照，看其中是否含有和标准品一样的成分。
本次检测，是从专门做奈玛特韦原料药出口的企业那里，拿到了HPLC的色谱条件，以及奈玛特韦的标准品。奈玛特韦在上市之前的代号是PF-07321332，分子量499.5
LC-MS取样及检测结果
由于凯喜博士检测结果反馈的是印版绿盒Primovir中的奈玛特韦药片中不含有奈玛特韦，所以本次LC-MS检测就只检测奈玛特韦药片，而不检测利托那韦药片。
抱着微乎其微的希望，期盼着发生某几盒可能是真药的奇迹，所以对每个样品进行了严格的标记。即在每个绿盒上、每一板奈玛特韦上、拟取样的奈玛特韦单片都进行了统一的标记，这样万一有一盒是真的，也能对应上。
1.方法和材料
标准品配置
取奈玛特韦标准品25 mg于烧杯中，加入约2 mL 50%乙腈中（乙腈：纯水；1:1, v/v），涡旋使其充分溶解，转移至25 mL的容量瓶中，2 mL 50%乙腈洗涤烧杯并转移至容量瓶中，重复洗涤4次。使用容量瓶准确定容，配置成浓度为1 mg·mL-1的标准品贮备液。
利用标准品贮备液配置浓度梯度为10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000 、10000ng·mL-1的奈玛特韦标准品用于标准曲线的绘制。
样品处理
称量每一片药品的质量后，加入到2 mL刻度的离心管中，同时加入一颗4 mm的小钢珠，使用组织研磨仪以30 Hz的频率高速振荡4 min，重复振荡4次直至药品被研磨成粉末状。加入1mL的50%乙腈，涡旋30 s后，使用组织研磨仪振荡萃取4 min，然后以10000 r·min-1的转速离心10 min后提取上清液至25 mL的容量瓶中，重复此过程5次。完成萃取后，使用容量瓶定容到25 mL。取定容后的待测溶液1 mL命名为NMTF-Mx。
1.3 质量控制与质量保证
样品处理过程中添加过程空白和过程加标样品，进样过程中每隔8针进样1针溶剂空白（50%乙腈），定量分析使用上述配置的标准液所制得的标准曲线，仪器残留和过程空白中均有300-400响应的残留，而10 ng·mL-1仪器响应为2000，在计算含量时候减去仪器残留和过程空白的响应。
为确定萃取效率，取2 mg药品加入2mg的奈玛特韦标准品，采用与样品相同的方式进行操作，萃取效率在98%±1.5%。
为确定是否存在基质效应，取标准品贮备液加入到6-8号药物样品的待测溶液、稀释10倍和稀释100倍的溶液中，上机检测，并与相同浓度的标准品响应对比计算基质效应。结果表明待测溶液、稀释10倍和稀释100倍的溶液均不存在基质效应。
2.实验数据图
图1 奈玛特韦标准曲线
图2 标准品全扫色谱图
图3 标准品全扫质谱图（备注：负离子模式，m-1，所以为498.2）
图 4 八个药品及过程空白和标准品的总离子色谱图
图5 M1全药样品的全扫质谱
从上述样品全扫描质谱图5中（以1号药片M1样品为例），未找到有效成分的奈玛特韦特征质谱碎片，表明样品中未检测到奈玛特韦。
进一步对样品的质谱图进行MRM模式的分析，如下图所示
图6、八个药品及过程空白和标准品的MRM模式色谱图
图6中，质谱所用的分析模式是MRM模式，通过定量离子（498.3→471.3）、定性离子（498.3→471.3）及保留时间分析，在标准品奈玛特韦出峰的位置，所有样品均出现了一个小峰，但峰高和面积与过程空白一致，因此通过MRM分析进一步证实样品中无目标化合物。
结论
经过本次LC-MS检测，送检的8盒印版绿盒Primovir，在奈玛特韦药片中不含有抗病毒有效成分奈玛特韦。本次检测没有进一步分析该药片中到底含有什么成分，主要原因就是没有必要。因为既然没有奈玛特韦的有效成分，至于是否含有凯喜博士微博中所说的奥司他韦还是利托那韦，都不重要了，因为服用绿盒的Primovir不会给新冠感染病人带来任何获益，不但会耽误治疗，误导医生的治疗思路，与之相伴的只有利托那韦所带来的副作用。
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